科學家開發無柱純化高性能蛋白質製備方法，純度達到98%，可用於研發酶製劑和診斷試劑

近日，華南理工大學團隊打造出一種名為 cSAT2.0 的重組蛋白無柱純化技術，解決了標籤重溶的問題，讓無柱純化能夠達到 98% 的純度。

它不僅適用於實驗室水平，並能用於規模化的發酵罐生產和 96 孔板的高通量篩選。

cSAT2.0 在不使用色譜柱的情況下仍能獲得達到 98% 的純度，這主要得益於兩個巧妙的設計。

首先，研究人員通過結合可自聚集的自組裝肽和可自切割的內含肽建立了 cSAT1.0（即 cSAT2.0 的上一版本）。通過簡單地改變 pH，就可以實現自切割的內含肽，這樣一來就能對其進行定向進化改造，從而提高可控性和切割效率，由此所製備的目標蛋白具有天然序列，從而能在臨床應用產生重要價值。

其次，研究人員在 cSAT1.0 中引入一個來自耐輻射奇球菌的蛋白酶前肽，借此有效阻止了標籤重溶，從而能將純度提高到 98% 甚至更高。

特別有意思的是，該團隊發現來自其他物種的蛋白酶前肽並不能實現這一效果。其推測這可能是跟極端微生物為了抗逆而進化的一些蛋白序列特性有關。

理論來講，本次技術適用於所有蛋白純化製備與製造相關的應用，目前的技術成熟度大致是 5 級。眼下，該團隊正在將本次技術推向工業規模的應用，並將在以下領域佈局：

1、用於生物製藥行業。目前越來越多的蛋白類藥物包括多肽、抗體已被用於常見疾病和重大疾病的治療，甚至也被用於減肥領域，相關市場呈現出快速增長的趨勢。根據該團隊的初步估算，採用 cSAT2.0 技術方案至少能比現有純化方案節省一半的成本。

2、用於生物製造行業。酶廣泛用於生物化工、化學醫藥製造和食品行業，而 cSAT2.0 特別適用於酶製劑和診斷試劑的研發與生產。

3、用於化妝品行業。近年來，重組膠原蛋白等在市場上的成功，帶動了蛋白在化妝品日漸廣泛的應用。有機構預測目前這一終端市場將能帶來超萬億元的年銷售額。而該團隊的最新實驗數據表明，cSAT2.0 技術同樣適用於相關蛋白的規模製備。

4、用於蛋白藥或靶點的篩選服務。由人工智能輔助的蛋白設計和藥物開發，將成為生物醫藥研發的主流。而 AI 設計的蛋白需要高效的篩選技術來完成實驗驗證。目前，該團隊已經證實 cSAT2.0 可以在 96 孔板上操作，其也相信 cSAT2.0 會成為這個領域的一個標準篩選技術，並能在抗體表位識別、藥物靶點篩選、疫苗抗原開發等領域發揮作用。

近年來，該團隊一直聚焦於合成生物學底層技術的研究。本項目則是圍繞重組蛋白（酶）純化與製造來開展的。

眾所周知，蛋白純化是生物技術的核心技術之一，也是新質生產力重要賽道生物製造與生物醫藥的重要引擎之一。

蛋白純化長期面臨著一個重大挑戰：如何高效、低成本地把目標蛋白分離純化出來？

現有的技術依賴多步的柱層析，效率低、耗時長、成本高，這在規模生產中尤為突出，但一直無法突破。

大約 14 年前，該團隊意外發現某些自組裝短肽能讓目標蛋白特異性形成沉澱聚集體，與表達宿主的其它雜蛋白分開，而且能夠保持完全的生物活性，且通常並不減少其表達量。

基於此，課題組結合成熟的自切割內含肽，設計了一種可切割自聚集標籤的蛋白純化技術，並將其稱之為 cSAT（cleavable self-aggregating tag），借此建立了一種上述的重組蛋白無柱純化技術。

但是，其也發現目標蛋白在自切割之後，總是有小部分的 cSAT 標籤會因為重溶而汙染目標蛋白，導致最終純度一般在 80-90%。多年來，其一直在努力解決這個問題。

該團隊原先的設計是將一個具有雙親性的短肽，即將一個兼具親水部分和疏水部分的短肽，與一個目標蛋白融合表達，用於蛋白質工程改造。

後來，課題組的博士生吳偉發現融合蛋白在表達之後都變成沉澱了。一般情況下，表達後形成沉澱（通常稱之為包涵體）的蛋白，是沒有活性的。吳偉對此感到非常沮喪，當天中午連午覺都沒有睡，喝了一杯咖啡之後，回到實驗室乾脆不管三七二十一，測了一下蛋白活性。結果發現蛋白不僅有活性，而且與野生型相當。正是這一意外，讓該團隊發現並開創了 cSAT1.0。

而 cSAT1.0 自聚集標籤部分重溶問題，多年來都沒有太好的解決辦法。後來，課題組負責人林章凜從清華大學調到華南理工大學，並和楊曉鋒副教授組成團隊。課題組經過多次討論之後認為，標籤重溶可能是因為自組裝肽的組裝導致的空間擠壓。

由此，他們設想是否可以在 cSAT1.0 標籤中加一段多肽，借此增加自組裝肽的空間，從而使 cSAT 標籤不再重溶。

這期間，該團隊一直承擔國家 973 和重點研發專項合成生物學項目工作，涉及微生物和植物抗逆的人工元器件和基因回路設計。

在這十多年項目執行中，他們認識了幾位長期緊密合作的夥伴，其中就有來自中國農科院生物技術的合作者。後者長期研究耐輻射奇球菌，發現其許多蛋白能夠用於提高作物的耐旱耐鹽堿性能。

在此基礎之上，該團隊提出：是否可以在 cSAT1.0 標籤中加入一段來自耐輻射奇球菌的肽段？

後來，華南理工大學博士生黃源牽頭做完了這個實驗，並得到令人驚喜的純化結果，發現前肽能夠完美解決課題組一直要想解決的標籤部分複溶問題。

圖 | 相關論文（來源：Trends in Biotechnology）

黃源是第一作者，林章凜教授（目前任職廣東工業大學）和華南理工大學楊曉鋒教授擔任共同通訊作者 [1]。

目前，該團隊已經在籌建公司來推進技術產業化。另外，在篩選應用上他們正在結合 AI 輔助的蛋白設計，實現數據與製備技術雙驅動的蛋白質工程。

當前，cSAT2.0 主要用於大腸杆菌的蛋白表達系統，基於這一技術框架，還有望用於其他表達體系，比如用於酵母、哺乳動物細胞體系的蛋白純化技術。

研究人員補充稱：「回顧來看，一共有近十位的博士生以及多位碩士生參與了整個技術的建立。」

他們表示，中國已經是一個經濟大國，因此也有責任成為一個科技大國。這種情況下在生物技術領域，聚焦解決重大的底層技術問題，應該是科研人員的重要使命之一。自 1973 年以來，在現代生物技術發展歷史上，基因工程、聚合酶鏈式反應、蛋白定向進化等技術的研究者，不僅有多位獲得了盧保獎，同時這些技術也極大推動了生物技術、經濟和社會的發展。

因此，該團隊也將繼續致力於類似 cSAT2.0 的底層技術。最近，他們在 AI 輔助的蛋白挖掘與進化上也做出了一些不錯的結果，前者的相關論文已經發表於 Cell Reports，後者的相關論文很快就要進入投稿流程。

1.Huang, Y., Zhang, Y., Yang, X., & Lin, Z. (2024). A high-performance protein preparation approach in a single column-free step.Trends in Biotechnology.

排版：初嘉實