哈佛團隊研發新型CMOS芯片，成功監測超數千隻老鼠神經元，且實現90%的平均細胞內耦合率

近日，美國哈佛大學團隊研發出一種使用 CMOS 工藝製造的微孔電極陣列，其能用於並行細胞內記錄，從而用於突觸連接映射。當將這一陣列和微孔-神經元接口以及電流鉗電子器件結合一起，能在大鼠神經元培養中實現 90% 的平均細胞內耦合率，從而能夠生成包含豐富突觸信號的細胞內記錄數據。（註：CMOS 的英文是 complementary metal-oxide semiconductor，中文翻譯為互補金屬氧化物半導體）。

從這些數據中，研究人員提取出 2000 多個神經元中的 70000 多個合理的突觸連接，總體誤差率大約為 5%。對於體外大鼠神經元，CMOS 微孔陣列平均實現了 90% 的細胞內耦合率，在最好的情況下為 97%，平均細胞內記錄振幅和細胞內耦合持續時間大約是此前方法的五倍。

同時，它還可以在相同的神經元上恢復細胞內耦合，而採用更具侵入性的傳統納米針陣列則很難實現這一效果。這種映射規模遠遠超過了任何其他電極技術能夠實現的規模。要知道 CMOS 納米針陣列只能繪製大約 300 個突觸連接的，而低通量膜片鉗和突觸不敏感的微電極陣列的效果更差。

與此同時，本次 CMOS 微孔電極陣列的可用性和性能均優於 CMOS 納米針陣列，它能將並行細胞內記錄變得簡單易用，並且仍能實現強大的突觸連接映射。

另外，它的微孔不僅更加容易製造，還可以廣泛使用。總的來說，這種規模的突觸連接性繪製以及表徵突觸連接的能力，讓人類朝著大規模神經元網絡的功能連接性繪製邁出了新的一步。

圖 | 相關論文（來源：Nature Biomedical Engineering）

哈佛大學 Jun Wang 是第一作者，哈佛大學樸洪坤（Hongkun Park）教授和韓德熙（Donhee Ham）教授擔任共同通訊作者 [1]。

突觸連接映射的需求仍未得到滿足

長期以來，電極一直是瞭解神經元及其網絡的窗口。一方面，膜片鉗電極具有細胞內記錄功能，可以高靈敏度地測量從一個到幾個神經元的小突觸信號。

另一方面，微電極陣列（MEA，micro electrode array）可以在細胞外並行記錄許多神經元，但是它對於突觸信號缺乏敏感性。

在微電極陣列類似的並行性條件下實現類似膜片鉗的細胞內靈敏度，可能為觀察和探究神經網絡中大量突觸信號開啟一扇新窗口，有助於繪製出該網絡的突觸連接圖並明確其連接強度特徵，這也是神經科學領域長期以來的一個研究課題。

因此，細胞內神經元記錄的並行化一直是領域內所努力實現的目標。但是，事實證明它非常具有挑戰性。對於各種類型的非膜片鉗電極來說，就算使用單個神經元，也很難真正地檢測突觸信號的細胞內記錄。

2020 年，該團隊通過在具有 4096 個記錄位點或像素的 CMOS 電子芯片上開發垂直納米針電極陣列，借此在並行細胞內神經元記錄上取得了顯著進展。

在使用電流鉗同時進行電流注入和電壓記錄操作中，由 CMOS 電路操控的納米針電極實現了細胞內記錄，從而能在單個像素上檢測到突觸信號，並且該陣列能夠支持並行操作。

當時，研究人員發現在最好的情況下，其能在 4096 像素的細胞內記錄 1728 個體外大鼠神經元中，並借此發現了 304 個突觸連接。而膜片鉗只能在細胞內記錄一到幾個神經元，因此這遠遠超出了膜片鉗的能力範圍。

儘管這一進展意義重大，但是這種 CMOS 納米針陣列既不具備日常使用的便利性，也不具備並行細胞內記錄的流暢性。由於納米針的製造過於困難，因此無法廣泛應用，而且當時這一設備僅能實現 5.8% 的平均細胞內耦合率。雖然其性能是當時最先進的，但仍然遠遠不能滿足突觸連接映射的需求。基於此，研究人員開展了本次研究。

六個單孔芯片的平均細胞內耦合率為 58%

在本次研究中，研究人員由代工廠製造了這款 CMOS 芯片，在其表面上具有 64×64=4096 個鋁像素焊盤，每個鋁焊盤用 2.6µm 厚的 SiO2/Si3N4 鈍化。

為了在每個焊盤上製造微孔電極，研究人員在鈍化層中蝕刻一個 1.2µm 深、10×10µm² 寬的阱，在阱中心蝕刻一個 1.4µm 深的孔，以便暴露下面的鋁金屬，並能針對 Pt/Ti 進行沉積。同時，他們在鉑表面的孔上電沉積鉑黑（PtB，platinum black），以便增加電極的表面粗糙度，進而增加其表面積和電導率。

研究人員表示，這種微孔電極的製造比垂直納米針電極的製造簡單得多。同時，單個神經元就能針對微孔實現完全覆蓋，這能減少為了啟動和維持細胞內記錄所需的膜通透性電流注射量。

除了偶爾的脈衝之外，微孔陣列每像素注入的電流大小，平均比納米針陣列大約減少五分之四。這些減少的電流不僅能夠減緩電極的劣化，而且由於對於電解質造成的化學擾動較小，因此所產生的氣泡也較少，同時還能減少對於細胞的干擾。這在很大程度上解釋了微孔陣列細胞內耦合持續時間和速率能夠得到大幅提高的原因，也解釋了其重新獲得細胞內耦合能力的原因。

同時，研究人員還開發了每個像素具有短路多孔電極的器件。單孔芯片每像素電極分佈較小，而多孔芯片的每像素電極分佈較寬，因此可以作為單孔芯片的襯底。

隨著向細胞內記錄的轉變，動作電位呈現正極性，其振幅增長了一到兩個數量級。實驗中，研究人員發現了一些小的突觸信號，比如突觸後電位（PSP，postsynaptic potentials）和其他亞閾值事件。

儘管電流注射一直在持續進行，但是細胞內信號最終還是在記錄軌跡中丟失，研究人員將記錄跡線中細胞內信號的丟失視為細胞內偶聯的丟失。然後，他們將六個單孔芯片與體外大鼠神經元連接，並在大量像素下進行這種細胞內記錄。

在前 20 分鐘的運行中，六個單孔芯片的平均細胞內耦合率為 58%，這遠遠超過了納米針陣列的平均值。整個實驗運行時長超過 60 分鐘，六個單孔芯片的細胞內偶聯率平均達到 90%，最高達到 97%。

這六個單孔芯片的細胞內記錄質量也優於納米針陣列。細胞內記錄的動作電位的平均幅度為 4.7 毫伏，細胞內耦合平均持續時間為 32 分鐘。

四個多孔芯片也都成功實現了大規模並行細胞內記錄，其平均細胞內偶聯率為 71%，持續時間為 13 分鐘，動作電位振幅為 0.9mV，這遠遠低於六個單孔芯片。

下圖 b 比較了單個單孔像素和多孔像素的記錄軌跡示例，而圖 e-h 則針對六塊單孔芯片和四塊多孔芯片的細胞內耦合速率、持續時間和動作電位幅度進行了比較。這些結果證實了單孔芯片中小電極分佈範圍的好處。

有趣的是，雖然多孔芯片在所有細胞內記錄指標上平均不如單孔芯片，但前者往往表現出相對較少的芯片間差異，從而在耦合持續時間和幅度上表現出像素間的差異。

研究人員還進行了另一個對照實驗，旨在展示孔嵌套孔電極的可能優勢。為此，他們製備出另外三個單孔芯片，這些芯片的孔電極周圍沒有設置小阱。

完成製備之後，研究人員進行了三組全陣列範圍的細胞內記錄。在細胞內偶聯位點總數和細胞內偶聯強度等性能指標上，那些孔電極直徑 d′=5 微米並且孔電極嵌套於小阱中的單孔芯片，往往要比對照組的單孔芯片有著更好的表現。

例如，前者的細胞內偶聯強度平均約為兩倍，這表明孔的存在可以提高密封阻力。也就是說，與垂直納米針電極相比，嵌套在孔中的單孔電極的改進，主要歸因於單孔電極的小範圍分佈。

如前所述，單孔芯片的細胞內耦合持續時間的顯著改善，是由於單孔電極被神經元完全覆蓋的可能性更高，因此電流鉗所需的電流注入更小、侵入性更小。然而，整體的小電流注入不是恒定的，而是變化的。

最初較大的電流有助於加速膜透性，以便快速獲得細胞內偶聯。而隨後較小的電流一方面用於維持獲得的透性從而維持細胞內偶聯，另一方面用於減緩電極劣化。然而，較大的初始電流不一定能保證細胞內耦合，稍後注入較小的電流可能會逐漸發生細胞內耦合。

AI 和神經形態計算均可從本研究受益

總的來說，大規模突觸連接和連接強度的繪製，可以使 AI 和神經形態計算等研究受益，並可能在篩選藥物對於神經網絡的影響上找到生物醫學應用。而本次由 CMOS 驅動的微孔電極陣列為這種突觸連接映射提供了一條途徑。一方面它易於操作，另一方面它能夠對神經網絡進行宏觀細胞內記錄。

通過在可插入大腦的三維絕緣棒陣列（而不是二維平面）上製造大量微孔電極，並將其應用於體內記錄，不僅可以增加每個神經元發現的突觸連接的平均數量，還可以將突觸連接結構與網絡行為聯繫起來。通過簡單地增加電極數量，可以進一步增加每個神經元發現的突觸連接的數量。

雖然用於電流箝制的集成放大器和電流注入器的數量無法像電極數量那樣很好地擴展，但可以利用開關矩陣技術，使用有限數量的有源電路來驅動更多的電極。不過，研究人員表示，此次展示的從全網絡細胞內記錄數據繪製突觸連接的過程只是一個開始，未來他們還將基於大數據開發更加複雜的映射技術。

參考資料：

1.Wang, J., Jung, WB., Gertner, R.S. et al. Synapaptic connectivity mapapping among thousands of neurons via parallelized intracellular recording with a microhole electrode array. Nat. Biomed. Eng (2025).https://doi.org/10.1038/s41551-025-01352-5

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