科學家研發新型螢光探針，通過螢光蛋白與阿片受體融合實時監控阿片肽結合過程，可用於疼痛管理和成癮治療

近日，美國加州大學大衛斯分校直博畢業生、目前在美國史丹福大學從事博士後研究的董春陽，聯合開發一款新型基因編碼螢光探針，為神經肽動力學研究提供了創新工具。

據介紹，本次研究的核心思想在於：將螢光蛋白與阿片受體融合，通過受體構象變化引起的螢光信號變化，來實時地反映阿片肽的結合過程。

期間，董春陽等人針對三種主要的阿片受體亞型——κ 受體、δ 受體和 μ 受體，分別設計了相應的螢光探針 κLight、δLight 和 μLight。

這樣一來，不僅可以區分不同類型的阿片肽，還能在單個細胞水平上實現高時空解像度的信號檢測。

通過開發和應用新型螢光探針，本次研究旨在從多個層面，深入探索阿片肽系統的功能和調控機制。

這不僅能幫助人們理解阿片系統在情感行為和動機行為中的作用，還可能為理解和治療相關精神疾病提供新見解。

通過研究分子水平的受體-配體相互作用、研究細胞水平和回路水平的信號傳遞、以及研究整體行為水平的功能調控，本次成果有望為阿片系統的研究帶來革命性進展。

它讓人們朝著更好地理解內源性阿片系統邁出了重要一步，為阿片肽系統的研究提供了富有價值的新工具。

對於當前的神經科學「工具箱」來說，內源性阿片類物質和合成阿片類物質的探針是一個很好的補充，能為阿片類信號傳導帶來更好的時空采樣。

這既能推動神經科學基礎研究的發展，也有望為疼痛管理、成癮治療等臨床應用開闢新前景。

從阿片類神經肽的「地位」說起

據介紹，在神經科學領域，阿片類神經肽系統佔據著核心地位。

而作為一類關鍵的神經調節物質，阿片肽在調控疼痛感知、獎賞行為、情緒反應、以及成癮過程等多個生理過程和病理過程中，扮演著不可或缺的角色。

然而，長期以來對於內源性阿片肽系統的深入研究，一直受到技術手段的限制。

免疫組化、放射性配體結合實驗等傳統研究方法，雖然能夠提供靜態的阿片肽分佈信息，但是難以捕捉到阿片肽在活體神經系統中的動態釋放過程和精細的時空分佈模式。

特別是在探究特定神經回路中的阿片肽功能，以及探究在複雜行為狀態下阿片肽釋放的動態變化時，現有技術往往顯得力不從心。

為了突破上述瓶頸，董春陽和合作者基於基因編碼開發出這種阿片受體螢光探針策略。

此前，董春陽的博士導師曾開發一種鈣離子探針 GCaMP3，該探針能在多物種體內使用螢光來解析腦神經活性，為高時空解像度檢測神經活性做出了重要貢獻。

也為鈣離子探針的優化奠定了一定基礎，目前 GCaMP 系列鈣離子探針已在神經科學領域得到廣泛應用。

董春陽導師的上述成果，為本次開發新型神經遞質探針奠定了基礎。

在導師的指導之下，這幾年來董春陽曾參與研究紅移的多巴胺探針，並開發出兩種 5-羥色胺探針、以及其他多種神經肽探針。

同時，董春陽還與北京大學李毓龍教授團隊合作發表了關於神經遞質探針開發和應用的綜述論文。這些經驗為他探索更加複雜的阿片肽探針提供了一定洞見。

在此基礎之上，董春陽意識到與之前開發的神經遞質探針相比，阿片肽探針的開發麵臨著更大的挑戰。

阿片肽系統非常複雜，其包括多種內源性阿片肽和多個受體亞型，這讓開發具有高度特異性的探針變得尤為困難。

而且與其他探針不同的是，阿片肽探針的開發沒有現成的公式可循。這意味著每一個探針變體都需要單獨設計和逐一驗證，這大大增加了工作量和複雜性。

比如，需要在保持受體功能的同時，找到最佳的螢光蛋白插入位點和連接序列。期間，涉及到大量的分子生物學工作，包括設計、構建和篩選數百個不同的變體。

而在體外表徵階段，則需要仔細評估每個探針變體對不同阿片肽和受體亞型的反應。包括詳細測定探針的動態範圍、靈敏度、選擇性以及反應動力學。

通過大量的體外表徵實驗，董春陽等人篩選出了動態範圍較大、靈敏度較高、特異性較高的變體。

隨後，他們圍繞探針的特異性開展驗證工作，並在強啡肽敲除小鼠和野生型小鼠之間，利用光遺傳刺激 BLA-NAc 回路的實驗，證明了 κLight 對於強啡肽的特異性。

這不僅能確保探針在複雜神經環境中仍能保持特異性和靈敏度，也確保了用戶在生理條件下使用探針的可靠性。

無數次的重覆、失敗、優化、再重覆

董春陽表示，本次研究的目標之一，是希望在體外和離體腦片中，全面表徵這些新型探針的藥理學特性。

包括測定探針對於不同內源性阿片肽和合成阿片肽的親和力、選擇性和動力學特徵。

在與傳統放射性配體結合實驗加以對比之後，他們希望驗證這些探針能否準確地反映阿片肽與受體的相互作用。

同時，還需要評估探針的表達，是否會影響內源性阿片受體的正常功能，以便確保其在生理條件下的應用價值。

本次研究的目標之二，是希望利用這些探針探索阿片肽在腦組織中的擴散特性。

此前，人們認為阿片肽主要通過體積傳遞的方式來發揮作用。但是，對於具體的擴散範圍和速率，始終缺乏直接的證據。

為此，該課題組設計了精巧的光解實驗，通過釋放光敏性阿片肽前體，來同時監測螢光信號的變化，借此首次實現了對於阿片肽擴散過程的實時觀察和定量分析。

通過這一實驗，他們不僅揭示了阿片肽的擴散常數，還為理解阿片肽信號的空間範圍提供了重要依據。

本次研究的目標之三，是希望確定能夠觸發內源性阿片肽釋放的最佳電刺激參數，這對於在體內研究阿片肽的功能至關重要。

通過在腦片中系統地調整刺激強度、刺激頻率和刺激持續時間，以及監測螢光探針的響應，該團隊希望找出最有效的刺激模式，從而為電生理實驗和光遺傳學實驗奠定一定基礎。

在活體動物實驗中，他們將這些螢光探針與光遺傳學技術加以結合，借此探索特定神經回路中的阿片肽釋放動態。

例如，通過在伏隔核表達 κLight 探針，以及在杏仁核表達光敏性離子通道，就能精確地控制特定投射的激活，並能實時觀察由此誘發的內源性強啡肽釋放。

這種做法的好處在於：不僅能提供前所未有的時間和空間解像度，還能揭示阿片肽釋放的空間特異性。

此外，課題組還開展了如下探索：即在複雜行為狀態之下比如在恐懼條件化過程和獎賞學習過程中，探索阿片肽釋放會發生的動態變化。

通過在自由活動的動物中開展光纖光度測量，董春陽等人用探針捕捉到了與特定行為相關的阿片肽信號變化。

他至今記得首次在活體小鼠中成功捕捉到內源性阿片肽釋放的瞬間。其表示：「我們花了幾年時間來優化探針，終於在體外確認了一個預期能在活體中成功應用的變體。」

詳細來說，他們將 κLight 質粒包裹到腺相關病毒之中，在熟悉小鼠腦區坐標之後，開始進行顱內病毒注射，然後等待探針在小鼠腦子裡表達。

「無數次的重覆、失敗、優化、再重覆，當在光線記錄的電腦屏幕上看到了 κLight 探針隨著恐懼條件刺激的進行，一個又一個明亮的信號峰開始出現，讓人確實有點感動。」董春陽說。

但是，科學的理性很快把他拽回來，他必須證明自己看到的是 κLight 檢測到強啡肽的信號而不是其他假象。

通過多隻小鼠證明上述現象的可重覆性之後，課題組通過設計不同實驗，尤其是使用強啡肽敲除小鼠的光遺傳實驗，證明在沒有強啡肽且刺激相同的情況下，探針不會出現信號，借此證明了探針的準確性和特異性。

最後，當各個實驗都指向一個特異性強且信噪比高的結果時，大家懸著的心才終於放下。

圖 | 相關論文（來源：Nature Neuroscience）

董春陽和美國華盛頓大學拉賈拿姆·高里尚卡爾 （Raajaram Gowrishankar）是共同一作。

美國華盛頓大學米高·布魯查斯（Michael R. Bruchas）教授、美國加州大學聖地亞哥分校馬修·班赫特（Matthew R. Banghart）教授、以及馬基斯普朗克佛羅里達州神經科學研究所田琳教授擔任共同通訊作者。

憑藉這一成果，董春陽獲得了美國國立衛生院托妮·希彭伯格 （Toni Shippenberg）青年研究者獎。

在應用前景上：

其一，能用於基礎神經科學研究。

本次打造的阿片受體螢光探針，將讓人們更精確地觀察和測量阿片肽在神經系統中的動態變化，從而幫助揭示阿片系統在各種神經過程中的具體作用，比如揭示學習作用、記憶作用、情緒調節作用等。

其二，能用於疼痛研究。

在疼痛調節中，阿片系統扮演著關鍵角色。因此，本次探針有望用於研究急性疼痛狀態下和慢性疼痛狀態下的阿片肽釋放模式，從而助力於開發更加有效的疼痛管理策略。

其三，能用於成癮機制研究。

通過實時監測阿片肽在獎賞回路中的活動，或能更好地理解藥物成癮的神經生物學基礎，從而為開發新型治療方法提供線索。

其四，能用於藥物開發和藥物篩選。

即本次探針或可被用於高通量篩選，以幫助識別新型阿片受體調節劑，從而助力開發更安全、更有效的止痛藥物。

其五，能用於情緒障礙研究。

鑒於阿片系統與情緒調節的密切關係，本次探針有望被用於研究抑鬱症、焦慮症等情緒障礙的神經機制。

其六，能用於神經影像學應用。

當把這些探針加以改造，則有望用於非侵入性腦成像技術，進而用於觀察人類大腦的阿片系統活動。

其七，能用於開發神經調控技術。

結合光遺傳學技術或化學遺傳學技術，這些探針有望幫助開發更加精確的神經調控技術，以用於治療與阿片系統相關的疾病。

其八，能用於行為神經科學研究。

即用於研究阿片系統在複雜社會行為、決策製定等高級認知功能中的作用。

其九，能用於預防藥物濫用。

通過深入瞭解阿片系統的功能，有助於開發更有效的藥物濫用預防策略和教育方法。

其十，能用於個體化醫療。

通過在動物模型中研究不同個體阿片系統的反應差異，或能為個體化疼痛治療和成癮管理提供理論基礎。

概括來說，這些潛在應用不僅有望推動神經科學基礎研究的發展，還可能會對臨床醫學、藥物開發和公共衛生政策產生重大影響。

當然，從基礎研究到實際應用，還需要多年的研究和驗證。

而在未來：

首先，將提高現有探針的性能。

即改善已有神經肽探針的特異性、靈敏度、動態範圍和動力學特性。

這可能會涉及到更複雜的蛋白質工程策略，比如 AI 輔助的定向進化、結構生物學指導的理性設計等。

其次，將開髮針對更多神經肽的螢光探針。

即把已有經驗擴展到其他的神經肽系統、神經遞質和神經調質之中。

再次，將已有探針與其他成像技術相結合。

例如，將神經肽探針與超解像度顯微技術或微型化的雙光子顯微鏡結合，有望讓人們在亞細胞水平、或在自由活動動物中，觀察神經肽的釋放動態。

同時，在多色成像技術的幫助之下，人們或能同時觀察多種神經肽或神經遞質的動態，從而能夠揭示它們之間的相互作用。

最後，這些探針的應用不僅限於基礎研究，還有潛力延伸到藥物開發領域，即用於開發高通量篩選平台，從而助力發現新的神經精神藥物。

對於神經肽探針來說，它也將繼續推動神經科學研究朝著更高時空解像度、更廣泛分子多樣性、以及更複雜行為的範式方向發展，為理解大腦功能和開發新型治療策略提供支持。

參考資料：

1.Dong, C., Gowrishankar, R., Jin, Y.et al. Unlocking opioid neuropeptide dynamics with genetically encoded biosensors. Nat Neurosci (2024). https://doi.org/10.1038/s41593-024-01697-1

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